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1. 預(yù)期用途

用于核酸檢測(cè)的第一個(gè) HPV 18 型 (HPV18) DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)由冷凍干燥的重組質(zhì)粒 pBR322 含有通過(guò)其獨(dú)特的 EcoR1 位點(diǎn)克隆的全長(zhǎng) HPV18 DNA (Quint et al., 2006)。 EcoR1 克隆位點(diǎn)位于 E1 基因內(nèi),。該標(biāo)準(zhǔn)已在純化的人類(lèi)基因組 DNA 的背景下配制,，以 0.5 ml 等分試樣凍干并在 -20 °C 下儲(chǔ)存。該材料在一項(xiàng)涉及 19 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的國(guó)際合作研究中進(jìn)行了校準(zhǔn)（Wilkinson 等人,，2010 年）,。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)包含第三方專(zhuān)有的材料，應(yīng)僅用于內(nèi)部校準(zhǔn)或工作用于擴(kuò)增和檢測(cè) HPV18 DNA 的標(biāo)準(zhǔn),。

本國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)不得用于任何其他目的,，并且使用后應(yīng)丟棄。

2. 注意

NIBSC 06/206 人乳頭瘤病毒18 型(標(biāo)準(zhǔn)品）

該制劑不適用于人類(lèi)或動(dòng)物人類(lèi)食物鏈。

該材料含有源自 C33A 細(xì)胞的 DNA,。和所有的一樣生物來(lái)源的材料,，該制劑應(yīng)被視為對(duì)健康有潛在危害。它應(yīng)該被使用和丟棄根據(jù)您自己實(shí)驗(yàn)室的安全程序,。這樣的安全程序應(yīng)包括戴防護(hù)手套和避免產(chǎn)生氣溶膠,。應(yīng)注意在打開(kāi)安瓿或小瓶，以避免割傷,。

3. 單元

HPV18 DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（NIBSC 代碼 06/206）已被規(guī)定為每安瓿 5 x 10^6 國(guó)際單位 (IU) 的單位,。

可追溯性聲明：

它是在 2008 年 1 月的 WHO 會(huì)議上提出的（Ferguson 等人，

2009) HPV18 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的使用說(shuō)明包括用于確定用于制定國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的散裝材料的理論 HPV18 基因組當(dāng)量 (GEq) 的計(jì)算和假設(shè),，從而證明 1 IU 相當(dāng)于 1 HPV18 DNA 的 GEq,。因此，第一個(gè) WHO HPV18 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的最終統(tǒng)一仍然是 IU,，而可追溯性聲明將允許用戶(hù)將 IU 等同于 GEq,。

在新墨西哥大學(xué) (UNM) 的 Cosette Wheeler 博士的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行了重組 HPV18 質(zhì)粒儲(chǔ)備制劑的 DNA 濃度測(cè)定。 DNA濃度通過(guò)260 nm處的吸光度以及使用Picogreen測(cè)定法（Invitrogen Corporation,，USA）的分光熒光法測(cè)定,。在兩次 DNA 測(cè)量之間獲得了 0.95 或更高的相關(guān)系數(shù)。事先為了遞送至 NIBSC,，將 HPV18 質(zhì)粒儲(chǔ)備制劑調(diào)整至 5 ng HPV18 質(zhì)粒 DNA/μl 的終濃度,。 UNM 實(shí)驗(yàn)室還向 NIBSC 提供了一份聲明，表明 HPV18 的 1.0 x 1011 GEq/ml 等于 1.27 ng/μl,。因此,，5 ng HPV18 質(zhì)粒 DNA/ul 質(zhì)粒儲(chǔ)備液相當(dāng)于 3.937 x 1011 HPV18 GEq/ml。 NIBSC 使用這些數(shù)據(jù)制定了 HPV 18 型 DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),。

為第 1 個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)制定散裝材料HPV 18 型 DNA（NIBSC 代碼 06/206）：

在 NIBSC,，大塊 HPV18 質(zhì)粒 DNA 材料是根據(jù)公式：

HPV GEq/ml 散裝材料 = (HPV GEq/ml 質(zhì)粒原液 x 體積質(zhì)粒原液)/體積散裝材料。

因此,，HPV18 GEq/ml 散裝材料 = (3.937 x 1011 HPV18 GEq/ml 質(zhì)粒原液) x (0.04826 ml HPV18 質(zhì)粒原液) / 1900 ml HPV18 散裝材料 = 1.0 x 107 HPV18 GEq/ml 散裝材料隨后將 HPV18 DNA 散裝材料以 0.5 ml 等分試樣冷凍干燥,。

第一次將 IU 等同于 GEq 需要某些假設(shè)HPV18 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)： 1) HPV18 的 1.0 x 1011 GEq/ml 等于 1.27 ng/μl； 2) 凍干后 HPV18 DNA 的活性沒(méi)有損失,； 3）重組HPV18質(zhì)粒DNA準(zhǔn)確模擬了生物樣本中HPV18病毒DNA的活性,。

獨(dú)立計(jì)算重組 HPV18 質(zhì)粒的 GEq/ml脫氧核糖核酸。

NIBSC 還使用 BioEdit 序列比對(duì)編輯器 v7.0.5.3 (Tom Hall, Isis 制藥公司,，美國(guó)）,。用于確定分子量的序列是 GenBank

pBR322 的登錄號(hào) J01749.1 和參考序列 HPV18（登錄 X05015）。

生物編輯數(shù)據(jù)DNA分子：HPV18登錄X05015

長(zhǎng)度 = 7857 個(gè)堿基對(duì)

MW= 4763530.00 道爾頓,，雙鏈

DNA分子：克隆載體pBR322

長(zhǎng)度 = 4361 個(gè)堿基對(duì)

MW= 2653867.00 道爾頓,，雙鏈

公式

根據(jù)以下公式計(jì)算 HPV 質(zhì)粒原液的 GEq/ml：

HPV 質(zhì)粒原液的 GEq/ml = (HPV 質(zhì)粒原液的 DNA 濃度) x (HPV DNA 的 MW + pBR322 的 MW)-1

x (阿伏伽德羅數(shù)) 其中阿伏伽德羅數(shù) = 6.022x1023 分子/mol GEq/ml 大量 HPV DNA 材料根據(jù)以下公式計(jì)算：

HPV GEq/ml 散裝材料 = (HPV GEq/ml 質(zhì)粒原液 x 體積質(zhì)粒原液)/體積散裝材料,。

計(jì)算

將重組 HPV18 質(zhì)粒原液提供給 NIBSC濃度為 5 ng/μl，因此 HPV18 質(zhì)粒的 GEq/ml庫(kù)存是：

= (5 x 10-9

g/μl) x (mol/(7417397 g) x (6.022x1023 分子/mol)

= 4.059 x 108 分子/μl

= 4.0591 x 1011 分子/ml

= 4.059 x 1011

HPV18 GEq/ml

將 48.26μl 重組 HPV18 質(zhì)粒原液稀釋至終體積為 1900ml,，因此：

HPV18 GEq/ml 散裝材料 = (4.059 x 1011 HPV18 GEq/ml 質(zhì)粒原液) x (0.04826 ml HPV18 質(zhì)粒原液) / 1900 ml HPV18 散裝材料= 1.031 x 107 HPV18 GEq/ml 散裝材料

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NIBSC 06/206 人乳頭瘤病毒18 型(標(biāo)準(zhǔn)品）

4. 內(nèi)容

生物材料原產(chǎn)國(guó)：英國(guó),。

每個(gè)安瓿含有 0.5 ml HPV18 質(zhì)粒 DNA 的凍干當(dāng)量，稀釋在 10 mM Tris 緩沖液 pH7.4 中,，含有 1 mM EDTA,、5 mg/ml 海藻糖和約 1 x 106 人 Geq/ml C33a 細(xì)胞。

5. 存儲(chǔ)

收到時(shí),，安瓿瓶應(yīng)存放在 -20 °C 或以下,。

請(qǐng)注意：由于凍干材料固有的穩(wěn)定性，NIBSC 可能會(huì)在環(huán)境溫度下運(yùn)輸這些材料,。

6. 開(kāi)瓶指南

DIN 安瓿瓶有一個(gè)“易開(kāi)”顏色的壓力點(diǎn),，窄的安瓿桿在此與較寬的安瓿瓶主體相連。各種類(lèi)型的安瓿破碎機(jī)可商購(gòu)獲得,。要打開(kāi)安瓿,，輕輕敲擊安瓿以收集底部（標(biāo)記）末端的材料，然后按照安瓿隨附的制造商說(shuō)明進(jìn)行操作

7. 材料的使用

在重新配制之前,，不應(yīng)嘗試稱(chēng)量?jī)龈刹牧系娜魏尾糠帧?/p>

HPV18 DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)包含高拷貝數(shù)模板。 HPV18質(zhì)粒的風(fēng)險(xiǎn)很高,，打開(kāi)玻璃安瓿時(shí)通過(guò)霧化造成 DNA 污染,。材料必須在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中打開(kāi)和處理，遠(yuǎn)離試劑,、實(shí)驗(yàn)室器具和樣品等其他預(yù)放大組件,。

該材料以?xún)龈尚问教峁褂们皯?yīng)在 0.5 ml 無(wú)菌無(wú)核酸酶水中復(fù)溶,。確保安瓿的內(nèi)表面被添加的水潤(rùn)濕,，以便重組粘附在玻璃上的任何凍干材料顆粒。

重組材料的最終濃度為 1 X 10^7 IU/mL,。

重組材料適用于校準(zhǔn)內(nèi)部或工作標(biāo)準(zhǔn),，用于擴(kuò)增和檢測(cè) HPV18 DNA(WHO/IVB/10.12)。該材料不應(yīng)用于校準(zhǔn)或評(píng)估提取,、沉淀或離心程序,。 NIBSC 可以為在提取步驟無(wú)法與擴(kuò)增步驟分離的分析中使用 06/206 提供指導(dǎo)（例如進(jìn)樣、應(yīng)答平臺(tái)）,。該材料尚未針對(duì)人類(lèi) DNA 核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行校準(zhǔn),。

NIBSC 06/206 人乳頭瘤病毒18 型(標(biāo)準(zhǔn)品）